OBTENCIÓN
DEL EXTRACTO DE ALOE VERA
Según Conaza. (1990) Para obtener el extracto o
acíbar de la sábila artesanalmente, se procede de
la siguiente forma:
Se escogen las hojas más grandes procurando al
hacer el corte, de no lastimar las más jóvenes. Se
deben cortar de 8 a 12 hojas de la planta en forma transversal y
se cuelgan de manera que la parte seccionada quede hacia abajo,
con el objeto de que escurra el acíbar por 24 horas, de
esta manera se recibe el jugo en un recipiente de lámina
galvanizada cubierta de resina epóxica, colocando sobre
baños de agua
fría. Después de esto se envasa.
Según Vickery, A R. (1994) Otro método de
extracción consiste en moler las hojas por cualquier
medio, centrifugar los residuos, filtrar el jugo y
envasarlo.
La producción promedio de acíbar
obtenido de esta forma es de 10 ml por cada hoja de tamaño
medio.
La extracción debe hacerse cuidadosamente para
evitar que las proteínas
se desnaturalicen y pierdan su actividad catalizadora, por esta
razón debe evitarse que las hojas una vez cortadas sean
expuestas al calor, a altas
concentraciones salinas o pH
extremos.
El manejo del acíbar en el transporte se
hará a la menor temperatura y
lo más rápido posible, y deberá refrigerarse
una vez que ha sido extraído.
El jugo contiene dos fracciones: una fase acuosa llamada
gel de Aloe y otra liposoluble denominada aceite de
Aloe, a partir de estas dos mezclas se
obtienen productos
entre los que destacan los fármacos, cosméticos,
solventes y perfumes.
El proceso
moderno para la elaboración del jugo, consiste en someter
a las hojas de Aloe a un tratamiento de corte y
comprensión simultánea para extraer la mayor
cantidad de jugo posible, después el extracto crudo pasa
por las fases de desinfección, calentamiento,
estabilización y envasado.
Oxidación con peróxido de hidrógeno.
Conaza. (1992) Exposición
a los rayos ultravioleta en presencia de catalizadores
químicos.
Alta temperatura en poco tiempo
(71-77°C durante o menos de 3 min.)
La última de las técnicas
arriba mencionadas es la más recomendable, ya que
introduce pocos cambios en la composición original del
producto.
En Cuba el CIDEM
(1996) tiene las especificaciones del extracto acuoso de Aloe
vera siendo la metodología la siguiente.
Después de cosechadas las hojas fresca se lavan
con agua corriente, deben ser almacenadas en frío antes 24
horas. Se someten a un proceso de bioestimulación durante
9 – 15 días protegiéndose de la luz.
Se lavan las hojas con agua corriente y posteriormente
se lavan con agua desionizada. Se recogen las hojas limpias en un
tanque de acero inoxidable
y se procede a su molí nación.
Se mezcla con agua desionizada (relación 1: 1.5)
con el reactor se extrae con agitación suave a temperatura
ambiente
durante 1 hora, Posteriormente se calienta hasta la temperatura
de ebullición y se refluja durante 30 mim.
Se enfría 50 – 60 º C se filtra a
través de gasa, recogiendo el extracto en un tanque de
acero inoxidable.
Se le añade metíl parabeno y el
propíl parabeno preservar en el alcohol
etílico al 95% y agitar durante 30 mim. Para su completa
disolución.
Se pasa a un tacho disolutor y se adiciona Metasulfito
de sodio se agita y se filtra y se recircula hasta obtener un
líquido transparente se enraza con agua desionizada y se
homogeniza.
COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA
SÁBILA (Aloe vera esp. Barbadensis
miller)
La sábila se ha ganado el sobrenombre de "planta
milagrosa "por los numerosos beneficios que aportan los
aproximadamente 200 elementos que la componen. El análisis fotoquímico de la
sábila refleja que contiene proteínas en 0.013 %,
polisacáridos 0.2 – 0.3 %, resinas 40 – 80 %,
aloína 20 %, aceites esenciales, alcaloides,
glucósidos cardiotónicos, taninos, glucosa, agua
y otros (Retamar, 1995).
La sábila contiene 13 de los 17 minerales
necesarios para la buena nutrición, aporta 20
de los 22 aminoácidos conocidos, ocho de estos son
esenciales y deben ser proporcionados desde una fuente externa,
ya que el cuerpo no los puede producir y está probado que
consumir el jugo de sábila es una de las mejores fuentes para
proporcionar al cuerpo estos aminoácidos. La sábila
también contiene enzimas naturales
y minerales necesarios para el organismo ya que las enzimas
ayudan a realizar la reacción química de vitaminas,
minerales y hormonas.
(Yaron, 1995).
Entre los elementos químicos que conforman la
sábila se mencionan:
- Aminoácidos: (aporta 20 de los 22 que requiere
el organismo) lisina, valina, leucina, fenilanina, metionina,
ácido aspártico, ácido glutámico,
arginina y serina. - Minerales: calcio, magnesio, potasio, cloro, hierro,
zinc, cobre,
cromo, azufre, aluminio,
sodio y germanio. - Oligoelementos: manganeso, calcio, potasio, sodio,
aluminio, hierro, zinc, cobre, plata, cromo, fósforo y
titanio. - Vitaminas: A, B1, B2,
B5, B12, C, ácido fólico y
ácido nicotínico (niacina). - Polisacáridos: celulosa.
- Carbohidratos: glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa,
acetilmanosa (acemannan). - Prostaglandinas y ácidos
grasos: ácido ganmalinoleico. - Aceites esenciales: trazas de aloesinas.
- Enzimas: oxidasa, catalasa, amilasa, lipasa,
fosfatasa alcalina. - Antraquinonas: aloin, barbaloin y ácido
aloético.
El germanio es un componente muy especial, que halla se
en grandes cantidades en todas aquellas plantas
consideradas milagrosa. El doctor Asai descubrió que las
setas y el Aloe vera contenían germanio en grandes
cantidades y demostró que este es de importancia capital para
la vida de estas plantas debido a su papel catalizador,
comparable al de la clorofila.
Su composición y propiedades
físico-químicas y farmacológicas pueden
variar en función de
la lluvia o el riego, del terreno, de la época de
recolección de las hojas y de su edad y almacenamiento, y
según la forma de obtención del gel y su
almacenamiento. Un 99,4% del peso del gel de Aloe vera es
agua. Más del 60% de los sólidos totales son
polisacáridos mucilaginosos ligados a azúcares como
glucosa, manosa, ramnosa, xilosa, arabinosa, galactosa y
ácidos urónicos.
El mucílago está compuesto de diferentes
polisacáridos neutros, ácidos y acetilados
(mananos, glucomananos, galactomananos,…), responsables de la
gran capacidad que tiene la planta para retener agua y gracias a
la cual puede sobrevivir en condiciones de sequía. Los
polisacáridos mucilaginosos son los principios
activos
responsables de la actividad biológica del gel de Aloe
vera, y entre ellos destaca el acemanano: "Que ha despertado
gran interés
por sus propiedades farmacológicas y como componente
activo importante del gel de áloe" y el aloérido:
"Polisacárido de elevado peso molecular recientemente
identificado, constituido por glucosa, galactosa, manosa y
arabinosa, y que según parece posee una actividad
inmunoestimulante superior a la del acemanano".
Los restantes sólidos que componen el gel de
Aloe vera, que también pueden contribuir a su
actividad terapéutica, son sales orgánicas y
ácidos (glutámico, málico,
salicílico, cítrico, lactato magnésico,
oxalato cálcico, …), enzimas (celulosa,
carboxipeptidasa, bradikininasa, catalasa, amilasa, oxidasa,
tirosinasa), sapogénicas, taninos, esteroles,
triglicéridos, aminoácidos (lisina, histidina,
glutamina, arginina, ácido aspártico, asparagina,
treonina, serina, ácido glutámico, glicina,
alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tiroxina,
fenilalanina y triptófano), RNA y trazas de alcaloides, de
vitaminas (betacaroteno, B1, B2, B3, B6, C, E, colina,
ácido fólico) y de minerales (aluminio, boro,
bario, calcio, cromo, cobre, hierro, potasio, magnesio, sodio,
fósforo, estroncio, silicio). No debe contener nunca en
cantidades apreciables derivados hidroxiantracénicos o
antraquinonas de acción
laxante. ( Granados, S. y Castañeda, A. 1998)
PROPIEDADES DEL
ALOE VERA ESTUDIADAS POR DIFERENTES INSTITUCIONES
Y UNIVERSIDADES DEL MUNDO.
- Nutritivo
- Estimulante del crecimiento celular
- Regenerador celular
- Antioxidante
- Antimicrobiano ( bactericida y fungicida
)
Nutritivo.
Aporte de elementos minerales esenciales.
Macro elementos: Potasio, calcio, magnesio,
fósforo, azufre.
Micro elementos: Cloro, cobre, hierro, manganeso, zinc,
boro.
Otros elementos esenciales: Germanio, sodio, aluminio,
cobre, plata, cromo.
Estimulante del crecimiento
En la composición química del gel de
Aloe, se encuentra el fosfato de manosa, su principal
función es que actúa como agente de crecimientos de
los tejidos. El
ácido ascórbico se considera benéfico para
el crecimiento, ya que puede retrasar la formación de
sustancias semejantes a la melanina, que inhiben el
crecimiento.
Regenerador celular.
Los polisacáridos contenidos en el gel de
Aloe, entre los que se encuentran los glucomananos, los
cuales constituyen alrededor del 0.2 – 0.3 % del gel fresco
y otros con elevados contenidos de galactosa, pentosa y
ácidos urónicos, los hacen casi insustituibles como
regeneradores titulares.
Antioxidante.
La vitamina C (ácido ascórbico) se
considera benéfico ya que este puede retardar el
oscurecimiento de algunos tejidos recalcitrantes, debido
probablemente a su capacidad para actuar como agente
reductor.
Antimicrobiano.
Los áloes muestran una actividad inhibitoria de
algunos Bacillus, bloqueando la síntesis
de los ácidos nucleídos en las bacterias,
acción debida probablemente a las antraquinonas. El
conjunto de antraquinonas (aloin, barbaloin y ácido
aloético) produce un efecto antibiótico y
antiviral. La saponina y aloetina presentan un carácter antiséptico y un amplio
espectro antimicrobiano (bactericida y antivirosa) estos
compuestos neutralizan el efecto de las toxinas microbianas. Se
ha demostrado que desde el punto de vista biológico los
taninos están relacionados con la resistencia de
las plantas a las infecciones y se consideran potentes agentes
antifúngicos. (Castillo E. N 2002)
CULTIVO "IN
VITRO".PRIMERAS CONTRIBUCIONES
El punto de partida en el cultivo in vitro es
difícil de determinar, pero importantes contribuciones se
remontan a 1860-1861 años en que Sacko y Knops
descubrieron que las sustancias más importantes absorbidas
por las plantas eran los compuestos
orgánicos. El resultado de estas observaciones fue la
elaboración de una sustancia nutritiva (solución
Knops) empleada hasta la fecha y que históricamente se
usó como componente básico de medios de
cultivo.
Rechinger, (1893) describió la formación
de callos en fragmentos aislados de tallo y raíz.
Haberlandt, (1902) asimiló todos estos conceptos
existentes en aquel entonces y fue el que realizó los
experimentos
más importantes respecto al cultivo de tejidos, ya que
propiamente cultivó células de
mesófilo de tradescantia en un medio artificial.
Haberlandt, sin embargo, no pudo obtener división celular
en sus cultivos, la razón fue en parte debido al medio de
cultivo relativamente simple, no obstante, una gran
contribución de Haberlandt fue la especulación de
la fitohormona que se llamó Traumatina.
Con todos estos conceptos fundamentales White, (1934)
demostró que era factible cultivar con éxito
órganos vegetales; demostró además que los
tejidos vegetales en cultivo, ya sean células
somáticas aisladas o formando agregados podían
vivir normalmente in vitro y sin
diferenciación.
Gautheret, (1955) como citólogo observó
las células en cultivo y describió en detalle, el
crecimiento in vitro de las células del cambium y
la fisiología de células de zanahoria.
Usó principalmente la solución de Knops como medio
básico, suplementado con glucosa, extracto de levadura y
cisteína.
Después de 1935, cuando conocieron las
condiciones del crecimiento y la división de
células homogéneas, aparecieron numerosos
artículos en los que se experimentaban mejores condiciones
para una rápida división celular, mayor velocidad del
crecimiento y otros componentes del medio de cultivo. Así,
Robbins, (1936), estudió el efecto de microelementos
inorgánicos y señaló que el zinc, manganeso
y el boro eran necesarios para el cultivo de ápices
radicales. Murashige y Skoog, (1962), estudiaron y propusieron la
composición de los medios de cultivo al medio revisado
para obtener una velocidad mayor en el crecimiento de
células de Nicotiana tabacum in
vitro.
Al finalizar la década de 1930, la ciencia fue
estableciendo los nutrientes esenciales para elaborar medios de
cultivo, como consecuencia, se determinó que los
aminoácidos y las vitaminas desempeñaban un
importante papel en la organogénesis.
Para el cultivo de ápices y meristemos no existe
un medio universal, sin embargo, el medio basal propuesto por
Murashige y Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus
ingredientes ha sido el más frecuentemente utilizado,
reportándose su utilización en la mayoría de
plantas obtenidas in vitro.
En los años 1957 y 1958 se elaboraron los medios
de cultivo necesarios para que a partir de grupos de
células se pudieran regenerar nuevas plantas por procesos
conocidos por morfogénesis y
embriogénesis.
Skoog y Miller (1957) fundamentaron la hipótesis de que la iniciación de
tallos y raíces en callos cultivados, podían ser
regulados por rangos particulares de auxinas y citocinas. Se
encontró que fragmentos de callos transferidos a medios
líquidos y agitados, producían una
suspensión que se podía propagar a través de
subcultivos (Muir, 1953). El grupo de
Steward realizó cultivos en suspensión de
zanahoria, haciendo evidente que esa técnica
ofrecía mayores potenciales para el estudio de muchas
facetas de la biología celular
(Nickel, 1956).
Nickel (1956), para estudios de
fitofisiología y bioquímica, ha experimentado el cultivo
masivo o cultivo en tanques con medios líquidos;
además investigaron los efectos del abastecimiento del
aire, control de pH,
remoción de medio de cultivo y otros aspectos
más.
El medio de White, (1934), citado por Orellana, (1994),
fue el más utilizado en los primeros tiempos de la
micropropagación, muchas mejoras han sido hechas desde
entonces, siendo las más notables el mejoramiento de los
niveles de N, P, K, la reducción del nivel de calcio y la
precipitación de hierro a pH altos (Hu y Wang,
1983)
COMPONENTES
DEL MEDIO DE CULTIVO
Medio de cultivo
El medio de cultivo es la combinación
sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente
incluye sales inorgánicas, carbohidratos,
vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal
y puede ser suplementado con algún regulador de
crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias. (
Debergh, P. 1982)
El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962),
es muy usado, particularmente si el objetivo es
regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de
este medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios
derivados, ha sido de un gran valor en el
cultivo de células y protoplastos, y también es
utilizado eficazmente en regeneración de plantas. La
diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor
concentración de nitratos en B5. El medio de baja
concentración de sales está especialmente indicado
para especies leñosas.
Componentes minerales.
Los componentes minerales esenciales para la vida de las
plantas se dividen en:
Macro elementos
Se utilizan en grandes cantidades: carbono,
oxígeno, hidrógeno,
nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, calcio y
magnesio.
Micro elementos
Aunque son necesarios en menor cantidad, juegan un papel
esencial en los mecanismos enzimáticos como activadores o
constituyentes de las coenzimas.
Los principales micro elementos son: hierro, cobre,
zinc, manganeso, molibdeno, cobalto y boro. Los microelementos
resultan indispensables para el crecimiento, intervienen como
activadores de sistemas
enzimáticos. Se suministran al medio de cultivo bien con
el objetivo de evitar cualquier carencia o se utilizan a
concentraciones mas elevadas con el objetivo de provocar una
activación del crecimiento.
Las exigencias minerales varían con la especie,
la naturaleza del
tejido y su estado
fisiológico, también varían con el
método de cultivo y el tipo de órgano
génesis estudiado.
Murashige y Skoog en (1962) propusieron un
medio para la investigación del crecimiento óptimo
de callos de tabaco
(Nicotina tabacum). Este medio es netamente superior a los
medios anteriormente usados para iniciar la órgano
génesis y, particularmente, para la neoformación de
yemas. (Medio MS)
A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado
de una manera muy general para todos los tipos de cultivo "in
vitro". Además, puede afirmarse que ha sido la
utilización del medio MS junto con el empleo de
fitohormonas apropiadas (citoquininas y auxinas), lo que ha
permitido el éxito de los trabajos sobre órgano
génesis en cultivo "in Vitro".
Componentes orgánicos.
Dentro de los componentes orgánicos de los medios
de cultivo tenemos azúcares, vitaminas,
aminoácidos, productos orgánicos estimulantes y
reguladores del crecimiento.
Azúcares.
Los tejidos y células cultivadas "in
vitro" son ampliamente heterótrofos con respecto al
carbono debido a la ausencia o insuficiencia de
asimilación clorofílica. Luego, resulta
indispensable añadir azúcares a los medios de
cultivo, siendo los dos más utilizados la sacarosa y la
glucosa.
La concentración óptima del azúcar
en los medios de cultivo varía entre 20 – 80 g/L, en
dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los
azúcares presentan una acción metabólica y
energética.
Vitaminas.
Las vitaminas favorecen el crecimiento de los tejidos en
cultivos "in vitro" y no se excluye que la falta de alguna
de ellas pueda ser un factor limitante de los fenómenos de
organogénesis. (Dr. González, S )
El compuesto que mas frecuentemente se añade a
los medios de cultivo es el mio-inositol, se emplea en
concentraciones entre 50 – 500 mg/L y su efecto se
evidencia sobre la proliferación de tejidos y sobre la
activación de la organogénesis.
El ácido ascórbico (1 – 10 mg/L) y
el ácido cítrico (50 –100 mg/L) se utilizan
en ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes
para evitar el oscurecimiento de determinados tejidos.
Aminoácidos.
El aporte de aminoácidos favorece la
proliferación de callos, aunque cuando más se acude
a los mismos es en las experiencias sobre la órgano
génesis y
en la multiplicación vegetativa "in
vitro". Las mezclas de aminoácidos parecen
también presentar efectos sinérgicos estimulando
fuertemente la proliferación de callos y la órgano
génesis. Los efectos obtenidos mediante el aporte de
aminoácidos parecen muy variables
según la especie y el tipo de morfogénesis
estudiada. Hasta el momento no es posible establecer una regla
general.
Reguladores del crecimiento
(fitohormonas).
Según Drew, R.A. (2003): Los reguladores del
crecimiento y el desarrollo de
las plantas actualmente se agrupan en cinco categorías:
auxinas, giberalinas, citoquininas, ácido abscísico
y etileno. Además de estas sustancias naturales
(reguladores endógenos) existen numerosos productos de
síntesis que pueden utilizarse como reguladores del
crecimiento en el cultivo "in vitro".
En los métodos de
propagación "in vitro" se emplean ampliamente las
auxinas; en la órgano génesis y las aplicaciones a
la multiplicación vegetativa está ampliamente
ligada a la utilización conjunta de auxinas y
citoquininas. La importancia de las giberalinas en cultivo "in
Vitro" está mucho más restringida.
El ABA (ácido abscísico) y los compuestos
que desprenden etileno se utilizan con menor frecuencia en casos
más específicos. aminopurina o N6-benciladenina).
Recientemente se ha descrito que la N-6- bencil aminopurina (BAP)
o N6-benciladenina (BA) ha sido aislada de plantas y constituye
también una citoquinina natural. En cultivos de tejidos,
el BAP y las citoquininas sintéticas Kinetina y TDZ
(thidiazuron) son las más frecuentemente
usadas.
Las citóquininas estimulan la división
celular (cariocinesis) en cultivo de tejidos vegetales y tienen
un efecto sinérgico en este sentido con las auxinas. Se
han reportado otros efectos de las citoquininas, por ejemplo:
estimulan el alargamiento celular de discos de hojas etioladas;
inducen la formación de órganos en una gran
variedad de cultivos de tejidos "in Vitro"
(morfogénesis); controlan la formación de
proplastidios en cloroplastos; mantienen la maquinaria de
síntesis de proteínas mediante la regulación
de la síntesis del RNA; retrasan la senescencia;
etc.
Las citóquininas que se usan con mayor frecuencia
en los medios de cultivo son: la kinetina (KIN), la 6-bencil
aminopurina (BAP), la 2-isopenteniladenina (IP) y la
zeatina. El BAP se emplea con frecuencia debido a su gran
actividad y su bajo costo.
Generalmente las citoquininas se evitan o se emplean en dosis muy
débiles en los medios de enraizamiento porque presentan un
efecto inhibidor sobre la rizogénesis.
Los aspectos relacionados con la luz que son importantes
en los cultivos "in Vitro" son: La cantidad de luz:
(irradiación) y la calidad de la
luz:( espectro).
La alternancia de los ciclos de luz con los de
oscuridad: (El foto período). Considerando estos aspectos,
los tubos con los meristemos se ponen bajo luz fluorescente (en
general de 1,000 a 3,000 Kw./m2) – en ocasiones es necesario
utilizar una irradiación menor en los primeros días
después del aislamiento- bajo un foto período de
14-16 horas y a una temperatura de 23-25ºC para el
desarrollo adecuado de las Vitro plantas.( Pérez L.
1992)
El cultivo in vitro se realiza dentro de espacios
denominados cámaras de cultivo, diseñados para
permitir el control del ambiente físico al que será
expuesto el cultivo. Determinar la temperatura óptima de
crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un
proceso muy laborioso que, además, exige gran cantidad de
cámaras de cultivo reguladas de forma
diferente.
Afortunadamente, y para la mayoría de
situaciones, se pueden obtener resultados satisfactorios con
temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y
280C.
Así, temperaturas bajas (del orden de
4–50C) permiten superar los periodos de
dormición de algunas leñosas y la
conservación prolongada de determinados cultivos "in
vitro" mientras que una temperatura constante de 200 C
induce la formación de raíces en la mayoría
de coníferas. (Grattopaglia, D y Machado, M.A.
1990)
La luz, definida como una forma de energía
radiante que se nos manifiesta mediante la visión es, en
realidad, parte de un fenómeno físico más
amplio: la energía radiante (radiación), que puede ser descrito
según dos modelos
diferentes: el modelo
ondulatorio (radiación electromagnética) y el
modelo corpuscular.
La luz es uno de los factores principales que determinan
el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica
la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in
vitro. Fenómenos propios del desarrollo de las plantas
(germinación, floración, tuberización,…)
pueden ser activados por el número de horas diarias de luz
que recibe la planta. De forma análoga, el número
de horas de luz que recibe el explante cultivado in vitro
puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor foto
período in vitro. (Crops Research Institute (CRI).
1995).
Consistencia del medio.
El uso del medio para el enraizamiento es un asunto muy
debatido, pues algunos autores prefieren el medio sólido y
otros el medio líquido; el medio liquido al menos para las
plantas leñosas han dado mejores resultados porque el
mismo favorecen la difusión de las exudaciones toxicas que
producen las plantas en cultivo, fundamentalmente los compuestos
fenológicos permite una mayor aeración y una mejor
absorción de los nutrientes presentes en el medió.
(García, 2000).
El medio para el cultivo de raíces in
vitro puede ser en forma liquida o sólida, a merced
del tipo de cultivo estando crecido para cualquier cultivo que
requiera que los tejidos o las células de la planta a ser
crecidas en la superficie del medio, debe ser salificado (mas
concretamente llamado ¨ galled¨ agar producido de algas
marinas, es el tipo mas común del agente gelatinoso y es
el ideal para estas aplicaciones. (Gamborg, 1968).
1.8.-
RIZOGÉNESIS. ENRAIZAMIENTO IN VITRO
Organogénesis
Es un evento morfogenético que se caracteriza por
su desarrollo unipolar, o sea, es la formación de un
primordio unipolar a partir de una yema con el subsiguiente
desarrollo de este en un brote vegetativo existiendo siempre una
conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno.
Estos brotes vegetativos son posteriormente puestos a enraizar en
otra etapa. Los brotes pueden formarse directamente a partir de
explantes (organogénesis directa) o indirectamente a
partir de callos. (Pérez Ponce. 1998.)
El término cultivo de meristemos ha sido
destinado para designar fragmentos de tejidos en un rango de
0.1mm – 1 cm o más. Sin embargo para el cultivo
aséptico y el saneamiento este término implica el
aislamiento del domo meristemático más el primer
primordio foliar en un rango de 0.1 – 0.5 mm (Herman, 1987;
citado por Pérez Ponce. 1998). A partir de ese
tamaño se considera cultivo de ápices.
Rizogénesis.
La rizogénesis es el fenómeno de
organogénesis mas generalmente implicado en la
multiplicación vegetativa. ( Sivory M./Caso 0 .
1980)
Hu y Wang (1983) Señalan conocimientos sobre la
Rizogénesis que condicionan por lo tanto el dominio de la
multiplicación vegetativa. El estudio de este
fenómeno pretende cada vez mas tener en cuenta las
interacciones complejas de factores, pero queda dominado por el
problema de la regulación hormonal y en particular por el
papel de las auxinas en la organogénesis.
Origen de las raíces.
Diferentes orígenes de los meristemos de
raíz.
Los meristemos de raíz se distinguen en varias
categorías según su origen.
- Los meristemos laterales de la raíz principal
se forman de una manera espontánea en condiciones
naturales. - Los meristemos adventicios son producidos por
órganos diversos, (tallo, tubérculo, bulbo. hoja,
etc.,) ya sea espontánea o accidentalmente, como
consecuencia de una herida. - Los meristemos neoformados en el seno de un callo, en
cultivo in vitro pueden ser considerados como un caso
particular de meristemos adventicios.
Etapas de la formación del meristemo de
raíz.
La neoformación de los meristemos de raíz
(como también de los meristemos de tallo) resulta siempre
de una desdiferenciación celular provocada. Que conduce a
la producción de células meristemáticas
primarias y a la
organización de un esbozo
meristemático.
La desdiferenciación procede por etapas
sucesivas, según la naturaleza de tejido original
(células peri cíclicas, células liberianas,
parenquimatosas o cámbiales) existen diversas modalidades
entre ellas.
- Las raíces adventicias pueden iniciarse en la
base de una yema después de la neoformación
previa de un callo cicatricial. - Las raíces adventicias pueden igualmente ser
iniciadas a partir de tejidos profundos. Lo mas frecuente es
que entonces sean formadas a partir del cambium. Las
células que la originan sufren una - desdiferenciación que conduce a la
formación de células meristemáticas
primarias.
d) Las raíces adventicias pueden mas raramente
provenir de tejidos superficiales, como la epidermis, en este
caso bastante raro, se encuentra en diversas familias como las
crucíferas, como el mastuerzo, y el berro.
Estas raíces son entonces denominadas como
exógenas en oposición al caso más general de
las raíces endógenas.
- Etapas de la rizogénesis
(Esquema hipotético y
simplificado)
Regulación hormonal de la
Rizogénesis.
Influencia estimuladora de la hoja o de la
yema.
Numerosas experiencias de brotación, han
demostrado claramente la influencia estimuladora que determinan
las yemas sobre la Rizogénesis lo que evidencia la
influencia de una sustancia con circulación polarizada,
que es el origen del concepto de
regulación hormonal de la Rizogénesis.
La o las sustancias estimulantes probablemente
resultarían de la actividad fotosintética de las
hojas, pero podrían igualmente provenir esencialmente de
las hojas jóvenes en crecimiento activo y eventualmente
del mismo ápice.
El estímulo proveniente de la hoja o de la yema
es el estimulador más frecuente de la Rizogénesis.
(Salisbury F/Ross. C, 1994)
Concepto de una rizocalina
específica.
Según investigaciones
realizadas la neoformación de raíces seria
desencadenada por la acción de una sustancia móvil
sintetizada por las hojas, y que emigraría de una manera
polarizada hacia la base del tallo. Esta sustancia
hipotética, específica de la Rizogénesis,
debería denominarse "rizocalina" y sería
transportada por el floema y acumulada en las yemas, los
cotiledones y las semillas.
Auxinas y
Rizogénesis.
El papel central de la auxina en el desencadenamiento
hormonal de la Rizogénesis viene sugerido a la vez por las
aplicaciones de auxinas exógenas y por las dosificaciones
de la hormona.
La aplicación del AIA frecuentemente estimula el
enraizamiento de los esquejes y se obtienen resultados similares
con auxinas sintéticas.
Las más eficaces son generalmente el ANA, AIB AIP
y el AIA, estas sustancias son ampliamente utilizadas en
horticultura y en arboricultura.
Las auxinas intervienen básicamente en dos
estados del enraizamiento:
- El primero, en el cual se forman los meristemos
radiculares, estado inicial de su crecimiento. Este a su vez se
puede dividir en un estado activo de acción de las
auxinas en el cual debe haber una continua presencia de
auxinas, pudiendo estas venir de los brotes terminales o
laterales o de una aplicación externa, y una segunda
etapa, la cual se puede denominar como de auxinas inactivas, ya
que estas están presentes en la raíz cuatro
días mas pero no tienen ningún efecto adverso en
su formación. - En la segunda etapa se da la elongación de los
primordios radicales, en esta la nueva raíz atraviesa la
corteza hasta emerger de la epidermis del tallo, para esto un
sistema
vascular ya se formó en la nueva raíz y se ha
fusionado a los tejidos vasculares del tallo, una vez llegado a
éste punto ya no hay mayor respuesta a las
auxinas.
Las semillas en desarrollo son un importante centro de
producción de AIA, como se ha demostrado en semillas de
maíz,
que alcanzan su máximo cuando aún están como
leche y, al
madurar, el AIA forma esteres con el mio-inositol.
En óvulos de algodón
también se han medido cantidades elevadas de
AIA.
En frutos, el contenido en AIA aumenta tras la
polinización alcanzándose un máximo;
así, en fresas se pasa de 3.6 mg de AIA a 127 mg de AIA
por frutos a los 12 días de la polinización e
iguales máximos se encuentran en manzanas, uvas, tomates y
otros.
En raíces se ha detectado AIA, aunque más
bien parece que procede de las partes aéreas. Se ha visto
que en raíces de maíz, hay más en la estela
que en el córtex y más contenido aún en la
cofia.
Se puede concluir que los lugares más importantes
de síntesis de auxina son: las hojas jóvenes en
expansión, el tejido cambial, los ovarios inmaduros y
semillas en desarrollo. Sin embargo, otros tejidos también
tienen la capacidad de sintetizar AIA (hojas maduras, tallos y
raíces). (Rojas Gardenias, 1993)
Interacciones de factores.
Parece evidente en la actualidad que la auxina no es el
único factor de Rizogénesis.
La aplicación de auxina sobre esquejes es
ineficaz en numerosos casos y a veces la eficacia no es
aclarada más que después de la primera
aplicación,
después de ablación de las raíces
neoformadas una segunda aplicación queda sin
efecto.
Todo sucede como si un factor de Rizogénesis pre
existente en el esqueje y movilizado por la auxina o se combinara
con ella, fuera rápidamente agotado.
Como consecuencia de numerosas experiencias se ha
formulado el concepto de "complejo rizocalinico", que
contemplaría al menos tres elementos: 1) un factor
móvil desconocido sintetizado en las hojas a la luz y que
emigra de forma polarizada, 2) la auxina, 3) un factor celular
existente sólo en ciertas células que
realizaría la fijación y la combinación de
los dos primeros
Un cierto número de hechos sugieren que
compuestos fenólicos podrían tomar parte del
complejo rizocalínico. La aplicación de
ortodifenoles exógenos sobre esquejes ha podido estimular
la Rizogénesis en algunos casos. Numerosos trabajos han
demostrado que compuestos difenólicos, tales como el
ácido clorogénico y el ácido cafeico, son
inhibidores de la axina-oxidasa. La acción de los
compuestos fenólicos podría ser directa o indirecta
por protección de la auxina o estimulación de la
síntesis de auxina.
Como todo fenómeno de organogénesis, la
Rizogénesis es ciertamente desencadenada por interacciones
entre "efectores" y "receptores sobre lugar".
Si se conocen las sustancias (auxinas, compuestos
fenólicos) y las condiciones que desencadenan o favorecen
la neoformación de raíces, se ignora siempre los
mecanismos fisiológicos íntimos.( Hu y Wang
1983)
Enraizamiento "in vitro"
MC Comb y Newton (2003),
afirman que en algunas especies, el enraizamiento in vitro puede
ser el único método para el enraizamiento de
plántulas sin embargo han descrito una técnica
donde insertan las base de los brotes en una espuma flexible de
poliuretano sumergido en un medio de enraizamiento líquido
las plántulas enraizadas de esta manera pueden ser
transferidas al suelo sin remover
el soporte.
Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se
realiza en la cámara de flujo laminar. Este método
permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que
éstos obtienen del medio la fuente de energía para
enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy
bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis. (Adelaja B. 1995).
SUPLEMENTOS NO
DEFINIDOS UTILIZADOS EN LA COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVO
Existen una lógica
bien documentada tras el uso de sustancias líquidas que se
encuentran en forma natural, con el uso individual de estas
sustancias se obtiene poco efecto por encima del esperado, parece
que las sustancias de
esta naturaleza pueden desempeñar un papel
pequeño pero significativo en la estimulación del
crecimiento en los tejidos de explantes, mediante la
división celular (Nitsch, 1962; Lee et al., 1965; Paulet,
1970).
Se puede anticipar que los investigadores en los
trópicos y subtrópicos tendrán acceso a una
gama de líquidos estimuladores del crecimiento que son de
origen novedoso, distintivos o incluso morfológicamente
únicos (Steward, 1959; Shantz, 1966).
Después de que Gautheret observó que el
extracto de levadura tenía efectos sobre las
células cultivadas in vitro, muchos investigadores
empezaron a buscar sustancias orgánicas que pudieran
ejecutar algún efecto morfogenético.
Principales sustancias promotoras del crecimiento de
naturaleza completamente indefinida.
- Agua de coco.
- Jugos de frutas y hortalizas (plátano y
tomate). - Extractos de levaduras, malta y tubérculos de
papa. - Endospermo líquido de Zea
mays. - Caseína hidrolizada.
Posiblemente el evento más significativo ante los
avances de la década de los 40, fue el descubrimiento de
las cualidades nutricionales del endospermo líquido del
coco. Existe una larga lista de componentes que se han adicionado
ocasionalmente a los medios de cultivo, como fuente de
nitrógeno reducido, factores de crecimiento,
carbohidratos, y otros.
Un paso importante en el desarrollo de las
técnicas actuales para estimular la división
celular de explantes fue la observación de que el agua de
coco, a niveles relativamente bajos podía interactuar con
las auxinas y promover el crecimiento, en situaciones en que por
sí solas era eficiente.
El agua de coco es un medio muy completo, con una amplia
gama de componentes orgánicos e inorgánicos, tiene
buena capacidad de amortiguación (buffer) y no es raro
encontrar, es rica en magnesio y fosfato, no todos los elementos
minerales que contiene son indispensables, y se puede reemplazar
por un medio salino basal.
Un medio de cultivo general preparado con reactivos
analíticos, con un suplemento de agua de coco, muy raras
veces resulta tóxico o deficiente a causa de los
micronutrientes.
Posteriormente el éxito de Van Overbeek y col.,
(1941) en el cultivo de embriones aislados de Datura en un medio
enriquecido con agua de coco, este extracto natural fue
rápidamente adoptado por otros investigadores.
La combinación de 2,4-D con agua de coco,
mostró un sorprendente efecto en la estimulación
del crecimiento de tejidos cultivados de zanahoria y papa. (
Caplin y Steward, (1948).
El uso del agua de coco y de 2,4-D en tubérculos
de papa por Steward, (1951) y del agua de coco con ANA por Morel
(1951) en las monocotiledóneas, fueron otros progresos
importantes. Estas observaciones constituyen la base para el uso
del agua de coco y sus sinergias en la nutrición de
células y tejidos cultivados in vitro.
Muchos investigadores encontraron que el extracto de
malta de cebada era benéfico como un suplemento, ya que ha
demostrado ser una fuente estimuladora de algunos
tejidos.
Los resultados acumulados de los estudios realizados de
esta temática, se resumen de la siguiente forma: en un
total de 166 pruebas (con
preparaciones de fuentes naturales) con 63 compuestos, 123 dieron
una respuesta positiva, mientras que 40 no dieron respuesta o
fueron negativos. El análisis de los resultados de estas
pruebas, refuerza el hecho de que diversos tejidos responden
diferentemente a varios suplementos.
El uso del medio para el enraizamiento es un asunto muy
debatido, pues algunos autores prefieren el medio sólido y
otros el medio líquido; el medio liquido al menos para las
plantas leñosas han dado mejores resultados porque el
mismo favorecen la difusión de las exudaciones
tóxicas que producen las plantas en cultivo,
fundamentalmente los compuestos fenólicos permiten una
mayor aeración y una mejor absorción de los
nutrientes presentes en el medio. (García,
2000).
El medio para el cultivo de raíces in vitro puede
ser en forma liquida o sólida, a merced del tipo de
cultivo estando crecido para cualquier cultivo que requiera que
los tejidos o las células de la planta a ser crecidas en
la superficie del medio, debe ser solificado (mas concretamente
llamado ¨galled¨ agar producido de algas marinas, es al
tipo mas común del agente gelatinoso y es al ideal para
estas aplicaciones. ( Gamborg, 1968).
Utilización del gel o extracto del Aloe
vera (L) N.L Burm.
En el área agronómica, el jugo de
sábila se ha usado experimentalmente como repelente e
insecticida en larvas presentes en algunas plantas tuberosas,
obteniéndose muy buenos resultados. De igual manera se ha
reportado la experimentación para el control de enfermedades virales en
papa, presentando una acción inhibitoria media en
comparación con otros extractos.
Por su parte, el gel de Aloe vera (L.) N.L.
Burm., ha demostrado su eficacia en la sustitución de
reguladores sintéticos en medios de cultivos para el
enraizamiento in vitro de plantas
medicinales y frutales en condiciones de campo,
también, potencialmente por sus características,
podría ser utilizado para estos fines.
(Rodríguez H., 2006).
Rodríguez H.,(2004) Señala que se
encontraron efectos estimulantes del crecimiento en los extractos
líquidos de plantas medicinales estudiados.,
correspondiéndole al extracto del gel de A. vera el
mejor comportamiento, particularmente con
relación a la formación de raíces, superando
incluso a los reguladores usados tradicionalmente como control,
lo que demuestra la posible presencia de actividad auxinica en el
mismo.
Jó María y col(2003) con diferentes
concentraciones de MS adicionando 20 y 40 mL/L de extracto de
Aloe vera en la micropropagación del plátano FIAH
18 obtuvo vitro plantas con buena respuesta fisiológica y
un enraizamiento excelente.
Jó María y col ( 2005 y 2006)
señala que se encontraron respuestas fisiológicas
en la fase de enraizamiento en la micropropagación del
plátano FIAH 18 en la Biofábrica de Pinar del
Río, utilizando diferentes concentraciones de MS
adicionando 20 y 40 mL/L del extracto de Aloe vera.
MICRO
PROPAGACIÓN DEL PLÁTANO EN
BIOFÁBRICAS.
Se caracteriza por tener la capacidad de generar gran
cantidad de plantas para la siembra en mediano plazo, en estado
fitosanitario relativamente óptimo, en relación con
algunas enfermedades. A partir de un ápice es posible
lograr en el lapso de un año, centenares de plantas libres
de nemátodos, hongos y de
algunos virus y bacterias
en comparación con el sistema tradicional Sandoval (1991).
En el ámbito comercial se basa en el uso exclusivo del
meristema o yema central para la propagación "in
vitro".
Este sistema presenta gran ventaja cuando se desea
realizar intercambio de plantas (germoplasma) o siembra de
musáceas en áreas relativamente nuevas. Pero el
tipo, cantidad de insumos e infraestructura necesaria para
garantizar un ambiente aséptico, incrementan los costos operativos
y, consecuentemente, los costos del producto (plántulas)
en relación con los sistemas de propagación antes
mencionados. Ello constituye una de las principales desventajas
para su uso masificado, principalmente entre los pequeños
y medianos productores. (Grisales, 1994).
Etapas de la micro propagación del
plátano
Esta técnica ha sido utilizada en diferentes
países (Cordeiro y Dos Santos, 1991; Crops Research
Institute, 1995, Adaleja, 1995), y en Venezuela fue
aplicada por primera vez por Hadad (1994) con notable
éxito. A partir de este momento ha sido adoptada como
alternativa de propagación rápida y masiva,
pudiendo ser aplicada a cormos provenientes de plantas
jóvenes o recién cosechadas.
Para su aplicación es necesario ubicar e
identificar las yemas presentes en el cormo, lo cual
permitirá que el sistema sea altamente eficiente. A
continuación se describe de forma general los pasos a
seguir para su aplicación. (Haddad 1994)
Este proceso incluye varias fases:
FASE 0: Preparación de la planta madre
FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de
asepsia
FASE II : Multiplicación de brotes
FASE III : Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación
FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA
MADRE
Para poder
establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo
adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a
las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar
entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se
va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición, del
fotoperíodo y de la irradiancia recibida.
FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE
ASEPSIA
Una vez escogida la planta madre, se extraerán
los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los
explantos.
Antes de extraer los explantes se hará una
desinfección de los fragmentos de planta madre para
eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el
material vegetal, se debe mantener en condiciones de
asepsia.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en
cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del
material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de
iniciación dentro de un bote de cultivo, para poder
controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.
FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS
BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobre
vivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o
adventicia) con varios entrenudos. Periódicamente estos
nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante
divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes
adecuados. Estas operaciones se
realizan en la cámara de flujo laminar.
FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE
ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente
dos métodos:
ENRAIZAMIENTO IN VITRO
Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se
realiza en la cámara de flujo laminar. Este método
permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que
éstos obtienen del medio la fuente de energía para
enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy
bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.
ENRAIZAMIENTO EX VITRO
Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio,
aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla
de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de
enraizamiento esté libre de organismos patógenos y
que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben
realizar fotosíntesis para que la planta tenga una
fuente de energía para enraizar y
desarrollarse.
Los explantes deben de plantarse en contenedores
cubiertos por un plástico,
para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en
el laboratorio, o
ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un
área sombreada con "fog-system" o
"mist-system".
FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS
ENRAIZADOS
Los explantes recién enraizados son muy sensibles
a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el
fracaso de todo el proceso dependen de la
aclimatación.
Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro
como ex vitro, en el momento en que se extraen los
explantes de los recipientes de enraizamiento están poco
adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han
enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy
elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al
descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para evitar la
desecación del explante.
Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de
humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad
relativa e incrementando progresivamente la intensidad de
luz.
Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos
también suele implicar la falta de una cutícula
cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la perdida
de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. (Alves E;
Oliveira M. 1993).
EXPERIENCIA EN LAS
BIOFÁBRICAS.
Situación actual de Cuba
Según Ponce (1998) en Cuba la propagación
masiva de plantas comenzó a finales de la década de
los 70, con laboratorios que producían de 100000 a 200000
vitro plantas anuales y paralelamente, los grandes centro
científicos del país y de las universidades
comenzaron a desarrollar tecnologías, no solo de cultivos
de tejidos sino también de diagnóstico, saneamiento e
identificación y caracterización de la variabilidad
soma clonal.
En 1987 se construye la primera Biofàbrica en
Cuba (primera generación) según el autor citado
anteriormente y entre 1987 y 1993 se construyeron otras catorce
que cubren la geografía
agrícola de casi todo el país, surgió en el
país el termino Biofábrica que ya se maneja en
muchos países a través del proceso investigativo y
de la experiencia práctica, se ha desarrollado cuatro
generaciones de Biofábricas en términos de diseño;
la más importante es la última, la cuarta
generación a la que se le incorporó una fuerte
componente de Investigación – Desarrollo.
Comportamiento de plátanos y bananas (Musa
spp) cultivados en la biofábrica
Este es el cultivo de mayor volumen de
propagación en el país, siendo así una de
las especies que está en todas las Biofábricas, por
lo cual ha sido una de las más estudiadas. Siendo hoy la
micro propagación el principal sistema de reproducción para los clones cultivados de
esta especie con producciones anuales entre 15 y 20 millones de
vitro plantas.( Pérez P. 2000)
La micro propagación en este cultivo se ha
empleado fundamentalmente para introducir de forma acelerada los
nuevos clones resistentes a la Sigatoka negra (Micosphaerella
figiensis), hasta diciembre de 1999 se habían plantado
en el país mas de 10000ha de clones híbridos
producidos en la Federación Hondureña de
Investigación Agrícola (FHIA) ello representa el
10, 58 % del área total nacional sembrado con clones
híbridos, esto se logró en un período de
apenas cuatro años.
El clon de mayor área plantada es al FHIA 03 con
3783ha y FHIA 18 y FHIA23 con 2822ha y 2877ha respectivamente,
distribuidos en todas las Provincias. (Ponce, et al
2000).
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Autor:
MSc. María Jó
García1
Msc. René Hernández
Gonzalo2
Dr. Santos Bustios Dios2
Ing. Maylin Esteves
López3
Ing. Yusbel Echevarria
Olivera3
Ing Maribel Rodríguez
Serrano3
MSc Ricardo Cruz Lazo2
MSc. Luis E. León
Sánchez2
MSc. Armando del Busto
Concepción2
1) Departamento de Biología
2) Departamento Agropecuario de la Universidad de Pinar
del Río;
3) Biofábrica de Pinar del
Río.
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